研究猕猴桃品种特征的分析方法及种间结构变化与形态特征分析
猕猴桃属属于猕猴桃科,包括66种和118个类群。刺槐是雌雄异株的,很少是单株的多年生异交藤本植物。该属的所有成员都能够最终靠倍体水平的变化来表征,包括二倍体(2n = 58),四倍体(2n = 116)和六倍体(2n = 174)。基于形态特征的猕猴桃分类是困难的,因为该属的显著形态变化和现有的网状种内和种间结构。
这些结构可能是通过自然杂交发生的。在过去的10年中,商业选择的猕猴桃品种数量明显地增加。从本质上讲,所有这些品种仅来自66种中的4种,这些物种存在于猕猴桃属中。水果市场上最受喜爱的猕猴桃品种是Actinidiadeliciosa(A. Chev.) C. F. Liang et A.R. Ferguson和紧密关联的Actinidia chinensisPlanch。
A. deliciosa和A. chinensis果实通常很大,60-100克,绿色或红色闪光。A. deliciosa的主要品种是“Hayward”。猕猴桃的健康益处部分归因于生物活性化合物,并具有高抗氧化能力,尽管它们的价值可以在成熟过程中发生明显的变化。不同的提取程序和抗氧化剂测定用于表征其生物活性化合物。
电泳分离能够区分半个耐寒猕猴桃品种,因此聚类分析揭示了有限数量的品种组。品种间多态性低,影响相似性分析结果。获得一个由两对栽培品种组成且蛋白质模式相同的不同簇。根据形态学描述,品种“Ananasnaya”和“Weiki”相似。相反,M1品种与其他耐寒猕猴桃品种在密度带强度方面存在显著差异。
所有检查的“Ananasnaya”品种的单一种子都具有相同的蛋白质模式。2011年和2013年收获的“宾果”和“Ananasnaya”耐寒猕猴桃的蛋白质模式是相同的。收获后三周储存不影响这些品种的蛋白质组成。介绍了耐寒猕猴桃的FT-IR和NMR谱图,并与“Hayward”和“Bidan”进行了比较,与蛋白质谱相比略有差异。
关于可用于区分猕猴桃基因型的生化标记的身份特征的知识有限。我们有兴趣了解来自水果的蛋白质模式的质量是不是足以将猕猴桃基因型分组,使用的工作量明显低于用于淀粉凝胶电泳(SGE)的工作量。植物育种者和食品化学家越来越需要开发可靠的方法来评估新的猕猴桃基因型。未曾发现任何基于生化标记显示猕猴桃物种之间的差异的出版物,作为蛋白质的电泳模式,也适用于区分A. arguta品种。
2011年和2013年,从波兰华沙生命科学大学环境保护系的实验生态领域收集了生长在沙壤土上的耐寒猕猴桃(A. arguta)植物。以下品种的果实:“宾果”(A. arguta和猕猴桃的杂交种),“M1(选择arguta),“Ananasnaya”,“Weiki”,“Jumbo”和“Geneva”是在它们吃水果柔软度的成熟时被拾起的。
此外,在收获成熟期(7°白利糖度)收集“宾果”和“Ananasnaya”的果实,并在收获后储存3周(1°C;95%RH),并在乙烯(500 ppm)存在下成熟至食用成熟阶段。水果首先在流水下清洗并冷冻,然后与波兰Kokanin 86的ELENA公司的果皮一起冷冻干燥。猕猴桃品种“Hayward”(A.deliciosa)和“Bidan”(A. eriantha)于2011年和2013年在韩国全南道希南县的果园中以有机系统种植,不用任何杀虫剂或除草剂。
所研究的猕猴桃品种如图所示。来自六种耐寒猕猴桃品种果汁的SDS-PAGE光谱。由六到七个波段组成,其中只有一个(M1)与其他耐寒猕猴桃品种的区别。水果冻干物提取物显示三种猕猴桃物种的蛋白质模式存在非常明显差异。耐寒猕猴桃的电泳光谱由13-14条不同强度的条带组成,分子量为14-52 kDa,而A.deliciosa和A. eriantha仅由一些条带组成(图)。2b,箭头a-c和h显示猕猴桃种类间的差异)。
耐寒猕猴桃品种的主要蛋白质条带在17-22 kDa和28-36 kDa范围内。在“海沃德”中,主要乐队分别为22、24和32 kDa。使用尿素缓冲液,在“Bidan”的蛋白质模式中只能获得六个尖锐的条带。其中一个条带的分子量为23 kDa,其强度更高,凝胶上染色的蛋白质量更高,与其他品种模式的条带强度相当。耐寒猕猴桃品种通过蛋白质模式几乎是单态的,品种间差异很小或未检测到任何差异。
根据蛋白质谱可以区分四组耐寒猕猴桃品种:第一组和第二组是两对相同的品种:“宾果”和“日内瓦”,以及“Ananasnaya”和“Weiki”。是1和“Jumbo”与其他品种明显不同。特别是M的蛋白质谱1与其他模式不同,由于条带:17 kDa和 52 kDa,而没检验测试到其他耐寒猕猴桃品种常见的31 kDa条带。
每个检查品种的电泳显示相同的模式.。大块样品的蛋白质谱由 24–26 条条带组成,其中三个区域有很密集的染色条带:16–22、29–33 和约 50 kDa。两个品种“Jumbo”和“Anananasnaya”与其他品种略有不同。从六个耐寒猕猴桃品种的单一种子中提取的蛋白质的电泳光谱由18-20条条带组成,但显示的模式多态性略高于从“批量样品”获得的模式。在M的模式中检测到轻微的品种间差异1、“巨型”和“宾果”品种分别为箭头 c-e)。
耐寒猕猴桃品种蛋白质模式之间的多态性水平较低。低水平的多态性决定了特定品种的模式-泳道之间的高度遗传相似性。发现两对品种的相似度为100%:“宾果”和“日内瓦”,以及“Anananasnya”和“Weiki”(相似性100%在矩阵上显示为系数1.00,.这些品种对代表相同的车道。这在某种程度上预示着从这个身份的角度来看,这些基因型是相同的。
其他耐寒猕猴桃品种的系数相似度较低,但不低于0.67。 “海沃德”和“比丹”品种之间的系数相似性较低,估计为0.57这些猕猴桃基因型与耐寒品种差异显著,相似度从0.29到0.67不等.。栽培品种的树状图分析无法将它们分组为不同的簇,除了两对相同品种的簇,并且部分生成了“Hayward”和“Bidan”的簇。
蛋白质谱的密度分析产生了部分“覆盖”彼此的曲线-泳道。在由峰组成的密度泳道过程中,峰高的定量差异较弱或无差异,特别是代表阿古塔品种的菌种。没有估计由于条带的存在或其强度缺乏差异而导致的峰高特征的任何显着性。
根据特定品种的密度学泳道无法区分A. arguta车道,除了M1.这与A. arguta品种低蛋白多态性的证据相对应。这种现象在主要峰值的曲线 达到最大高度(代表M1阿古塔栽培品种)—12,278,143。其他品种的高度略低。“Bidan”品种的密度曲线几乎是“平坦的”,与其他曲线不同。
在高水平DTT存在下提取蛋白质,以确保蛋白质完全还原。使用缓冲样品溶液提取阿古塔猕猴桃汁蛋白并不乐观,直到应用新的水果冻干液提取缓冲液并取得小进展。利用尿素缓冲液,我们在从猕猴桃组织(水果冻碱液,种子)中提取蛋白质的能力方面取得了进展。我们的结果与Vergara-Barberan等人一致,他们使用纤维素酶的酶辅助方案改进了橄榄叶中的蛋白质提取。
优化了影响提取过程的不同参数,例如有机溶剂的影响和数量、酶量、pH值以及提取温度和时间。用于实践目的的电泳图的改进是增加了在电泳图上检测到的条带数量(种子蛋白最多22-24条带)。其他研究人员已经获得了猕猴桃的种子蛋白模式,该模式仅由11条带组成。种子科学家的普遍观点是,种子蛋白特别适合于表征和区分作物品种的目的。
事实上,我们检查的品种之间的高度遗传相似性因素不允许根据从果实和种子组织获得的蛋白质模式来区分所有A. arguta品种。虽然,所有来自不同国家的A.a rguta原产地品种[Jumbo,Weiki和日内瓦分别在意大利、德国和美国被选中;是1和Bingo是在波兰选择的杂交品种],在凝胶上检测到的蛋白质多态性较低。
我们获得了有趣的数据,根据形态学描述,“Weiki”和“Ananasnaya”(来源不明)植物是相似的品种。从果汁和种子中分离的蛋白质模式变得无法区分。应该强调的是,根据同工酶特征区分A. deliciosa品种是困难的。
高分辨率聚丙烯酰胺梯度凝胶在品种鉴别方面仅略有改善。四个检查的耐寒猕猴桃品种中的一个在凝胶上与其他品种明显不同。这支持了我们关于耐寒猕猴桃基因型之间遗传变异性低的建议。“Hayward”和“Bidan”品种可以很容易地通过蛋白质模式来区分,尽管在凝胶上检测到的条带数量很少,特别是在“Bidan”中。
对这些结果的解释可以是两种基因型被归类到不同的材料遗传库中。然而,凝胶上检测到的不同条带有所增加,但表征A. eriantha品种的条带数量仍然低于其他检查的猕猴桃果实。密度测定分析显示密度测量峰呈平坦曲线,这是“Bidan”的典型特征。
根据这一特征,“Bidan”与其他被检查的品种不同。另一方面,M 的峰值1简历高于其他品种,它可以与该品种表现出的最高抗氧化活性有关。
为了说明猕猴桃品种的不同模式,图给出了每个品种的平均光谱。5.比较了猕猴桃甲醇提取物的红外光谱以及标准猕猴桃,如“海沃德”和“比丹”在共同峰范围内.。在我们之前的研究中,红外光谱多个方面数据显示猕猴桃样品中的主要条带略有偏移。
一些品种的核磁共振波谱如图所示。 转让1获得猕猴桃有机提取物(DMSO)的H光谱,主峰出现在2-6 ppm之间。三个品种的光谱相似,“Ananasnaya”的光谱略有4-5 ppm。代谢物混合物的主要和次要成分之间的浓度差异可能超出了核磁共振波谱仪的有限动态范围。在这种情况下,混合物中微量成分的检测限高于从混合物中分离的相同化合物的检测限。
在DMSO的情况下,主要是糖是主要化合物和芳香族部分是次要的(ppm):“Bidan”(6.8,16.7,22.6,60.6),“Hayward”(23.8,17.7,22.6,64.6),“Ananasnaya”(23.8,15.7,23.6,58.6)。使用核磁共振方法,已能鉴定不同水果的一级和二级代谢物,如葡萄、橙子、苹果汁、柑橘、橙子、猕猴桃、芒果、黑树莓、甜瓜、西瓜、蓝莓和桃子。
用于区分耐寒猕猴桃品种的SDS-PAGE由于品种之间的多态性较低,仅取得了部分成功。然而,在猕猴桃籽蛋白的情况下,我们获得了由多达24条带组成的模式。我们预计,在改进电泳方案后,这一特征既适用于区分耐寒品种,也适用于源自植物遗传源的猕猴桃基因型,具有更广泛的遗传变异性。
我们的结果,特别是关于奇异种子之间的遗传同质性,可以认为猕猴桃作为植物的代表具有很大的价值,这些植物不仅通过有性繁殖,而且通过营养繁殖繁殖。我们大家可以提出一种检查营养繁殖的新工具,这是正确完成的。匹配结果首次表明,红外和核磁共振波谱可用于快速估计提取的生物活性化合物,作为品种之间相似性和差异性的额外指标。SDS-PAGE蛋白分离比提取的多酚品种和FT-IR和NMR波谱测量的猕猴桃品种的估计效果更好。
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